Durante el proceso de qPCR, muchos compañeros pueden no entender bien qué significan términos como curva de amplificación, valor CT, línea base, línea de umbral, curva de melting, etc. Así que hoy vamos a echar un vistazo juntos a esas curvas tan desconcertantes en el proceso de PCR.

Curva de amplificación:Durante el proceso experimental de PCR cuantitativa en tiempo real, el instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real realiza una detección en tiempo real y registra las señales de fluorescencia a lo largo de todo el proceso de amplificación de la reacción de PCR; a medida que aumenta el número de ciclos de la reacción, las señales de fluorescencia registradas también se acumulan continuamente.

La curva de amplificación es la curva que describe el proceso dinámico de la PCR, con el número de ciclos como eje de abscisas y la intensidad de la señal de fluorescencia en tiempo real durante la reacción como eje de ordenadas. Las curvas de amplificación de la PCR cuantitativa fluorescente que se observan habitualmente suelen presentarse de dos formas: el gráfico logarítmico y el gráfico lineal.

Una curva de amplificación típica se puede dividir en cuatro fases: fase basal, fase exponencial, fase lineal y fase de meseta.

Línea base:En la parte horizontal de la curva de amplificación, la señal de fluorescencia amplificada queda enmascarada por la señal de fondo de fluorescencia, lo que impide determinar cambios en la cantidad de producto generado.

Fase exponencial:La amplificación exponencial de la PCR, “uno genera dos, dos generan cuatro, cuatro generan ocho”, la curva de amplificación comienza a elevarse; en esta fase todos los reactivos de reacción tienen excedente, la ADN polimerasa mantiene aún un alto nivel de actividad, la cantidad de producto de cada ciclo y la cantidad de plantilla inicial cumplen una relación exponencial, y existe una relación lineal entre el valor logarítmico de la cantidad de producto de PCR y la cantidad de plantilla inicial, por lo que esta fase es la más adecuada para el análisis cuantitativo.

Fase lineal:A medida que se consumen las materias primas, se acumulan los productos y se pierde la actividad enzimática, la amplificación del ADN deja de ser exponencial, el crecimiento de la señal fluorescente se desacelera gradualmente, la eficiencia de la reacción disminuye y la cantidad de producto ya no mantiene una relación exponencial con la cantidad de plantilla inicial.

PlataformaPeríodo:Debido al agotamiento del sustrato, la disminución de la actividad enzimática y otros factores, la señal de fluorescencia deja de aumentar y tiende a estabilizarse. Dado que los factores que afectan la amplificación por PCR son complejos y variados, el tiempo que tarda cada reacción en entrar en la fase plateau y la altura de dicha fase varían entre sí.

Línea base:La línea base es la señal de fondo de los primeros ciclos de la PCR, que presenta una forma de línea recta con fluctuaciones menores; en este momento, el software puede calcular automáticamente un rango de línea base razonable.

Línea de umbral:El umbral es un valor establecido artificialmente en la curva de amplificación de fluorescencia; puede fijarse en cualquier posición de la fase de amplificación exponencial de la señal de fluorescencia. Generalmente, el valor umbral de fluorescencia se establece en 10 veces la desviación estándar de la señal de fluorescencia de la línea base (fondo). El valor umbral de fluorescencia se establece en la fase de crecimiento exponencial de la PCR.

Valor de TC:El número de ciclos que experimenta la señal fluorescente en cada tubo de reacción hasta alcanzar el valor umbral establecido se denomina valor CT.

Curva de fusión y valor Tm:La curva de disociación se refiere a la curva del grado de degradación de la estructura de doble hélice del ADN a medida que aumenta la temperatura; la temperatura a la cual se degrada la mitad de la estructura total de doble hélice del ADN se denomina temperatura de fusión (Tm). Diferentes productos de PCR, debido a las diferencias en el contenido de GC, el tamaño del fragmento y la concentración de iones salinos, presentan valores de Tm distintos; por lo tanto, la especificidad de los productos de PCR puede verificarse según el valor de Tm.

Curva de calibración:Normalmente, se diluye en serie una muestra de concentración conocida, se toman muestras de cada dilución y se someten a PCR cuantitativa por fluorescencia, obteniendo una serie de valores de CT. Al representar el logaritmo de la concentración en el eje de abscisas y los valores de CT en el eje de ordenadas, se obtiene una curva estándar.

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