CCK-8 es un experimento de biología celular ampliamente utilizado en la proliferación celular y la citotoxicidad. La solución CCK-8 se puede añadir directamente a las muestras celulares, sin necesidad de preconfigurar diversos componentes. Cuanto más y más rápida sea la proliferación celular, más oscuro será el color celular, lo que demuestra que la toxicidad es baja; cuanto mayor sea la citotoxicidad, más claro será el color. Para las mismas células, la intensidad del color (cantidad de formazán generado) y el número de células presentan una relación lineal.

Células, placa de cultivo celular de 96 pocillos, incubadora de CO2incubadora, cabina de flujo laminar, micropipeta, lector de microplacas, kit CCK-8, etc.

4. Medir la absorbancia. Se recomienda utilizar doble longitud de onda para la medición, longitud de onda de detección 430-490 nm, longitud de onda de referencia 600-650 nm, o utilizar detección de longitud de onda única a 450 nm.

Fórmula de cálculo de la tasa de supervivencia celular=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%Tasa de inhibición=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100% As: absorbancia del pocillo experimental (con células, medio de cultivo, solución CCK-8 y solución del fármaco); Ac: absorbancia del pocillo control (con células, medio de cultivo, solución CCK-8, sin fármaco); Ab: absorbancia del pocillo blanco (con medio de cultivo, solución CCK-8, sin células ni fármaco) 

1. Si el volumen inicial de cultivo celular es de 200 μl, se deben añadir 20 μl de solución CCK-8, y así sucesivamente.

2. Se recomienda establecer 3 pocillos réplica para cada concentración de fármaco, y finalmente tomar el valor medio para elaborar la curva.

3. Diseñar bien los controles experimentales para eliminar en lo posible la interferencia de otros factores: 1) Control blanco: se pueden usar pocillos con la misma cantidad de medio de cultivo celular, solución CCK-8 y fármaco pero sin células; 2) Control negativo: pocillos con células sin fármaco pero con el disolvente del fármaco.

4. La detección del kit depende de reacciones catalizadas por deshidrogenasas; si la sustancia a analizar tiene propiedades oxidantes o reductoras, puede interferir en la detección y debe eliminarse (cambiar el medio fresco antes de añadir la solución CCK-8 para eliminar la influencia del fármaco. Si la influencia del fármaco es relativamente pequeña, se puede no cambiar el medio y simplemente restar la absorbancia del blanco tras añadir el fármaco al medio).

5. Prestar atención al tiempo de incubación tras añadir la solución CCK-8; la duración de la incubación depende del tipo celular y la densidad celular, entre otras condiciones experimentales. En el primer experimento se puede detectar con el lector de microplacas a las 0,5, 1, 2 y 4 horas respectivamente, y luego seleccionar un punto temporal con un rango de absorbancia adecuado para experimentos posteriores.

6. Cuando las células se cultivan en la incubadora, los pocillos del borde exterior de la placa de cultivo se secan y evaporan fácilmente, lo que aumenta el error debido a volúmenes inexactos. Generalmente, los pocillos del anillo más externo solo se llenan con medio de cultivo y no se utilizan como pocillos de medición.。

7. Si temporalmente no se mide el valor de DO, se pueden añadir 10 μl de solución de SDS al 10% a cada pocillo para detener la reacción, y cubrir la placa de cultivo y conservarla protegida de la luz a temperatura ambiente. Si se mide dentro de las 24 horas, la absorbancia no cambiará demasiado; generalmente se recomienda detectar de inmediato.

8. Antes de la detección con el lector de microplacas, asegurarse de que no haya burbujas en cada pocillo, de lo contrario interferirán en la medición.

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