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¿Con qué está relacionada la adhesión de células cultivadas in vitro?
En primer lugar, no todas las células se adhieren en cultivo in vitro, pero la mayoría de las células provenientes de tejidos y órganos sólidos sí se adhieren.
El proceso de adhesión podría ser así
Las células primero secretan matriz extracelular, y esta matriz extracelular se adhiere a la superficie del soporte (el fondo del frasco de cultivo, la placa de cultivo). Luego, las células se unen a esta matriz extracelular a través de las moléculas de adhesión que expresan en su superficie.
Por lo tanto, si las células se adhieren o no está relacionado con la capacidad de las propias células de secretar matriz extracelular y con la cantidad de moléculas de adhesión que expresan, así como con la estructura superficial de la pared de la placa de cultivo.
El proceso de adhesión celular provoca grandes cambios en la morfología; el cambio de forma celular es el resultado de la acción conjunta del citoesqueleto interno (que es un sistema de red de fibras proteicas en células eucariotas, compuesto por microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios) y la matriz extracelular.
Las células con densidad mayor que el medio de cultivo (la gran mayoría de las células) se sedimentan en el fondo, entonces para sobrevivir las células deben mejorar este entorno, secretar matriz extracelular, mejorar la estructura del fondo y luego, de forma natural, adherirse al fondo.
Las células con densidad menor que el agua, como los adipocitos, flotan en la superficie del líquido, por lo que no pueden adherirse al fondo; sin embargo, si se llena completamente el medio de cultivo, las células pueden entrar en contacto con la pared superior del frasco de cultivo y también pueden adherirse. Por lo tanto, se puede decir que la adhesión celular es una respuesta de adaptación al entorno.
A: Lo más importante en el subcultivo celular es el tiempo de tratamiento con tripsina: si la digestión es insuficiente, las células permanecen agrupadas; si el tratamiento con tripsina es demasiado prolongado, es fácil que se dañe la membrana celular, haciendo que la adhesión celular no sea firme, con una sensación de relieve débil al observar al microscopio, y en casos graves incluso puede causar la muerte celular, con muchas células flotantes, etc.
B: Falta de factores de adhesión: el suero contiene factores que promueven la adhesión; en los procesos con medios libres de suero, debido a la falta de estos factores, el efecto de adhesión celular disminuye considerablemente.
C: La contaminación por micoplasmas, bacterias u hongos provoca un fondo celular sucio, etc.
D: Preparación o almacenamiento inadecuado del medio de cultivo, como un medio abierto durante demasiado tiempo, precipitación de los factores añadidos, descomposición de aminoácidos, etc., que provocan una nutrición insuficiente.
E: Las células descongeladas ya están en mal estado, envejecidas y han perdido la capacidad de adhesión.
F: El número de células sembradas es demasiado bajo, no pueden secretar suficiente matriz extracelular.
G: La manipulación durante la descongelación es demasiado lenta, lo que facilita la formación de cristales de hielo que perforan la membrana celular.
Lo mejor es cultivar en frascos de plástico; si es un frasco de vidrio, se puede recubrir el frasco con colágeno de cola de ratón, o grabar el frasco con ácido clorhídrico, o recubrir con Laminina/fibronectina/colágeno/BSA, lo que también puede ayudar a las células a adherirse al nuevo frasco de cultivo; si las células se adhieren con dificultad, se recomienda tratar con polilisina.
1. Una solución de digestión adecuada y un buen medio de cultivo son el comienzo del crecimiento adherente celular; preparar un medio adecuado es un elemento clave.
2. Utilizar una matriz extracelular o un reactivo de adhesión adecuados.
3. Descongelar células nuevas y aumentar la concentración de suero al inicio para ayudar a las células a recuperarse.
4. En algunos subcultivos, la siembra debe hacerse de manera uniforme, utilizando el método de trazar un "8", para evitar que las células se agrupen y crezcan amontonadas.
5. Dentro de las 24 horas posteriores al subcultivo, es mejor no agitar ni observar el estado de las células, para no afectar la adhesión.
6. Las células epiteliales in vivo crecen sobre una membrana basal constituida por colágeno, por lo que cultivarlas sobre un sustrato con colágeno favorece su crecimiento.
Para células con adhesión débil y en cultivos primarios, a menudo se recubren los frascos/placas de cultivo utilizados; entonces, ¿cómo recubrir para que el producto despliegue su valor?
Fibronectina de plasma bovino: purificada de plasma bovino mediante cromatografía de afinidad, es un sustrato ideal para promover la adhesión y el crecimiento extensivo de las células. Puede unirse a los receptores de la superficie de la membrana celular y a la matriz extracelular, siendo un sustrato ideal para promover la adhesión y el crecimiento extensivo de las células. La concentración de recubrimiento recomendada es de 1-5 ug/cm2, siendo un sustrato ideal para promover la adhesión y el crecimiento extensivo de las células. Basta con incubar a 37 °C durante 1 hora o dejar toda la noche en refrigerador a 4 °C.
Polilisina: es un compuesto, un aminoácido con carga positiva, que promueve la adhesión celular modificando la carga eléctrica de la superficie del sustrato del medio de cultivo. Se recomienda usar una concentración de 2 ug/cm2; basta con incubar a 37 °C durante más de una hora antes de su uso.
Solución de gelatina al 0,2 %: la gelatina es una mezcla de proteínas hidrosolubles de alto peso molecular derivadas del colágeno. Se recomienda para el cultivo de células madre embrionarias humanas diferenciadas, así como de ciertos tipos de células primarias e inmortalizadas.
Líneas celulares que se cultivan mejor tras el recubrimiento: SHSY-5Y, INS-1, 293, Besa-2b, GH3, recuperación de cultivos primarios, etc.
