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En 1992, un investigador japonés, Higuchi, propuso la tecnología qPCR (Quantitative real-time PCR): una técnica que consiste en añadir grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR, utilizar los cambios en la señal fluorescente para monitorizar en tiempo real los cambios en la cantidad de producto amplificado en cada ciclo de la reacción de amplificación de PCR, y realizar un análisis cuantitativo de la plantilla inicial mediante el análisis del valor CT y de la curva estándar. Tras pasar de la investigación y desarrollo a la comercialización, en 1996, la empresa estadounidense Applied Biosystems (ABI) lanzó el primer instrumento de qPCR.
Actualmente, el marcaje y seguimiento de los productos de PCR se realiza principalmente mediante dos métodos: el método de colorante fluorescente y el método de sonda fluorescente, que pueden utilizarse tanto para análisis cuantitativo como para análisis cualitativo.
Método de colorante qPCR
En el sistema de reacción de PCR se añade un exceso de colorante fluorescente SYBR Green I. Este colorante solo se une al surco menor del ADN de doble cadena, no se une a la cadena de ADN monocatenario y, en estado libre, no emite fluorescencia; solo puede emitir luz cuando se intercala en la doble cadena de ADN. Por lo tanto, en el sistema de PCR, con la amplificación exponencial del producto específico de PCR, en la etapa de extensión de cada ciclo, el colorante intercalado en el ADN de doble cadena emitirá fluorescencia, y la intensidad de su señal fluorescente presenta una correlación positiva con la cantidad de producto de PCR.
Método de colorante qPCR
El valor CT de cada plantilla presenta una relación lineal con el logaritmo de la concentración inicial de la plantilla; cuanto mayor es la concentración inicial, menor es el valor CT. Utilizando estándares de concentración inicial conocida se puede elaborar una curva estándar, en la que el eje de ordenadas representa el logaritmo de la concentración inicial y el eje de abscisas representa el valor CT. A partir del valor CT obtenido mediante cuantificación fluorescente de la muestra problema, se puede calcular la concentración inicial de dicha muestra a partir de la curva estándar.
Curva estándar
La curva de fusión sirve para verificar la especificidad del producto amplificado. Si la curva de fusión presenta un solo pico (entre 80 y 90 °C), indica que solo hay un producto y el resultado es bueno; si presenta dos picos (hay picos tanto entre 70 y 80 °C como entre 80 y 90 °C), indica que el producto no es específico y que pueden existir dímeros de cebadores o amplificación inespecífica.
Curva de fusión de muestra normal
Curva de fusión de muestra anómala
A partir de los datos generados por el sistema de detección de qPCR, combinando la curva estándar y la curva de fusión, tras el procesamiento de datos se puede obtener la concentración de la plantilla inicial.
Características del método de colorante qPCR
El método de colorante es económico y asequible, pero como el colorante emite fluorescencia al unirse a cualquier ADN de doble cadena, su especificidad no es alta y es necesario realizar una curva de fusión para observar su especificidad.
En un laboratorio de secuenciación de alto rendimiento (tomando como ejemplo muestras de sangre), se extrae ADN genómico con un kit de extracción de ácidos nucleicos y, a continuación, se fragmenta, ensambla y recombina el ADN genómico para preparar un modelo de ADN remodelado, es decir, una biblioteca génica. Para realizar el control de calidad del producto de construcción de la biblioteca se utiliza la tecnología de colorante fluorescente qPCR, que pertenece a los métodos de cuantificación relativa.
Método de sonda qPCR
En el sistema de reacción de PCR se incluyen un par de cebadores y una sonda fluorescente específica. Dicha sonda es un fragmento de secuencia de oligonucleótidos específica, con un grupo reportero fluorescente y un grupo apagador fluorescente marcados en sus dos extremos respectivamente. Cuando la sonda está intacta, la señal fluorescente emitida por el grupo reportero es absorbida por el grupo apagador y no se emite fluorescencia. Durante la amplificación por PCR, la ADN polimerasa utiliza la actividad exonucleasa de la enzima para degradar la sonda, el grupo reportero se separa del grupo apagador y se emite fluorescencia. Finalmente, la señal es monitorizada y detectada por el instrumento de qPCR.
Método de sonda qPCR
A partir de la curva de amplificación generada por el sistema de detección de cuantificación fluorescente, se lee el valor CT de la muestra. Según los principios de interpretación de resultados, se realiza una interpretación precisa del resultado de cada muestra.
Valor CT de cuantificación fluorescente
El método de sonda solo recoge señal en el fragmento al que se une la sonda, por lo que tiene muy buena especificidad, pero el coste de síntesis de la sonda es relativamente alto.
Actualmente, con la evolución de la tendencia de la COVID-19, en el país no solo hay que prevenir y controlar la importación de casos del extranjero, sino también hacer frente a los nuevos casos locales y a los infectados asintomáticos. La detección de ácidos nucleicos se ha convertido en uno de los métodos más fiables para diagnosticar la infección por SARS-CoV-2. Dado que el método de colorante qPCR no puede identificar específicamente fragmentos de ADN, la mejor tecnología para la detección de ácidos nucleicos es el método de sonda RT-qPCR.
La detección de ácidos nucleicos del SARS-CoV-2 es un experimento cualitativo; basta con determinar, según el valor CT de la qPCR, si el sitio se detecta o no. Actualmente, los sitios de detección de ácidos nucleicos del SARS-CoV-2 incluyen principalmente 3 secuencias génicas conservadas del genoma viral, a saber, el marco de lectura abierto 1ab (Open reading frame 1ab, ORF1ab), el gen de la proteína de la nucleocápside (Nucleocapsid protein, N) y el gen de la proteína de la envoltura (Envelop, E), como dianas de detección. Según la Guía de técnicas de laboratorio para la detección de la neumonía por infección por SARS-CoV-2 (segunda edición) publicada por la Comisión Nacional de Salud, para confirmar un caso como positivo en el laboratorio se debe cumplir que, en una misma muestra, los resultados de la detección específica en tiempo real mediante RT-PCR de los 2 marcadores ORF1ab y gen N del SARS-CoV-2 sean ambos positivos.
Fuente de la imagen: sitio web oficial de la Comisión Nacional de Salud
Negativo: sin valor Ct o valor Ct>40.
Positivo: valor de Ct <37, se puede informar como positivo.
Sospechoso: valor de Ct entre 37-40, se recomienda repetir la prueba; si el valor de Ct <40 y la curva de amplificación presenta un pico evidente, la muestra se considera positiva; de lo contrario, negativa.
Actualmente, el mercado nacional de PCR ha experimentado un enorme incremento debido a la pandemia de COVID-19, elevando la prosperidad del sector. Con el desarrollo de la prevención y control de la epidemia, se han puesto de manifiesto las deficiencias en la capacidad de detección a nivel de base, y la Comisión Nacional de Salud ha emitido múltiples políticas exigiendo el fortalecimiento de la construcción de laboratorios y la mejora de la capacidad de pruebas de ácidos nucleicos. La amplia demanda del mercado y la expansión del ámbito de aplicación y la reducción de costos derivadas de la rápida iteración y actualización tecnológica, junto con el apoyo gubernamental que las acompaña, han propiciado un rápido crecimiento del tamaño del mercado de PCR. La industria de PCR se sitúa en la pista dorada del diagnóstico molecular, y se espera que el tamaño del mercado mantenga un alto crecimiento a largo plazo. Aunque la PCR digital ya ha aparecido, actualmente sigue en una etapa exploratoria en cuanto a aplicación clínica. Por lo tanto, la tecnología qPCR seguirá desempeñando un papel importante en el futuro mercado de diagnóstico molecular.
