Western Blot，又称蛋白质免疫印迹，是用来检测蛋白质的一种技术。其原理是：首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固相载体上，这一固相载体目前常用硝酸纤维素薄膜（NC膜）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）；固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为一抗）为探针，与固相载体上的蛋白质进行免疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的第一抗体的抗体（称为二抗）与一抗进行免疫反应，在有辣根过氧化物酶的底物和显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有一抗、二抗的待测蛋白，通过颜色反应既能显现出来；WB的优点是：高分辨率的电泳技术；特异敏感的抗原-抗体反应；可检测1~5ng中等大小的靶蛋白。
Western Blot整个实验流程可以分为蛋白样品制备、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、电转移、抗体孵育显色等五大步骤。
Western-Blot样品制备是实验的第一步，也是关键的一步，只有在获得高质量的总蛋白的前提下才有可能通过后续步骤检测到目的蛋白的表达；不同的样本，提取蛋白的方法略有不同，下面简单介绍不同样本蛋白质的提取操作。
1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷；
2.吸取细胞悬液，低速离心收集细胞，在1.5ml离心管中加入预冷的PBS，漩涡震荡，500 xg离心2~3min，清洗细胞，吸去上清，剩余与细胞体积相同的PBS，漩涡震荡重悬细胞；
3.按照下表1-1中相应体积的细胞裂解液，漩涡震荡裂解细胞(细胞数量和裂解液须保证对应关系，以达到最佳提取效率)；
4.将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000~16000 xg离心30s取出；
5.立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷；
2.将预冷的PBS直接加入培养板/培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞，吸取上清；
3.按照表1-2中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面，用移液器吹打几次，将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000~16000 xg离心30s取出；(如提取浓度不佳，可减少裂解液使用量）；
4.立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
以下步骤是从15-20mg组织中提取，如果起始量较大或较小，需调整相应裂解液的用量比例：
1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷；
2.将15-20mg新鲜/冷冻组织放置于离心管柱上，用塑料棍向下扭转反复研磨50-60次，加入200μl细胞裂解液，继续研磨30-60次；（注意：组织用量不要过量，无需过度研磨，裂解液可分两次加入以得到最佳效果；塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干）；
3.盖上盖子室温孵育1-2min，14000-16000 xg离心1-2min取出，收集管里的上清是抽提的总蛋白。
注：上述操作步骤及试剂用量均作为参考，具体用量以实际实验操作及产品说明书为准。
1.收集到的临床组织标本首先应尽快去除脂肪和坏死组织，并将蘸有的血液清洗干净，否则影响提取蛋白定量的质量和浓度；整理干净的标本立即放入液氮中冻存，至少应尽快放入-80℃冰箱，尽量减少蛋白的降解；
2.裂解细胞时，可将加了裂解液的样品置于冰浴上超声，以加快细胞的裂解，超声间隔时间应长于或至少等于超声工作时间，以使样本充分冷却，建议工作时间10~20s，超声功率设置时不能过大，过大会造成蛋白质焦化；
3.制备好的蛋白样品推荐根据每次实验的用量进行分装，做好标记，包括样品名称、提取日期等后存入-80℃冰箱备用，以免反复冻融加速蛋白的降解，冻存的蛋白保存时间不宜超过1个月。
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