1992年、日本の研究者であるHiguchi氏がqPCR（Quantitative real-time PCR）技術を提唱しました——PCR反応系に蛍光基を加え、蛍光シグナルの変化を利用してPCR増幅反応の各サイクルにおける増幅産物量の変化をリアルタイムでモニタリングし、CT値と標準曲線の分析を通じて起始テンプレートを定量分析する技術です。研究開発から市場化を経て、1996年、米国アプライドバイオシステムズ社（ABI）が初のqPCR装置を発売しました。

現在、PCR産物の標識と追跡は主に2つの方法で行われています——蛍光色素法と蛍光プローブ法であり、定量分析にも定性分析にも用いることができます。

qPCR検出システムが生成したデータに基づき、標準曲線と融解曲線を組み合わせてデータ処理を行うことで、起始テンプレート濃度を得ることができます。

qPCR色素法の特徴

色素法は経済的で手頃ですが、色素は二本鎖DNAであれば結合して発光するため、特異性が高くなく、融解曲線を作成してその特異性を観察する必要があります。

ハイスループットシーケンシングラボ（血液検体を例とする）では、核酸抽出キットを用いてゲノムDNAを抽出し、さらにゲノムDNAを断片化・連結・再構成して再構築されたDNAモデルすなわち遺伝子ライブラリを作製します。ライブラリ作製産物の品質検査には、qPCR蛍光色素技術が用いられ、この技術は相対定量法に属します。

PCR反応系には、一対のプライマーと特異的蛍光プローブが含まれます。このプローブは特異的オリゴヌクレオチド配列であり、両端にそれぞれ蛍光レポーター基と蛍光クエンチャー基が標識されています。プローブが完全な状態では、レポーター基が発する蛍光シグナルはクエンチャー基に吸収され、蛍光を発しません。PCR増幅時、DNAポリメラーゼはその酵素のエキソヌクレアーゼ活性を利用してプローブを切断・分解し、レポーター基とクエンチャー基が分離して蛍光を発します。最終的に、qPCR装置がシグナルをモニタリングし検出します。

蛍光定量検出システムが生成した増幅曲線に基づき、検体のCT値を読み取ります。結果判定原則に従い、各検体について正確な結果判定を行います。

プローブ法はプローブが結合した断片でのみシグナルを収集できるため、優れた特異性を持ちますが、プローブの合成コストが高くなります。

現在、国内のPCR市場は新型コロナウイルス感染症により巨大な増量をもたらし、業界の景況感は上昇している。感染症対策の進展に伴い、基層の検査能力不足という弱点が露呈し、衛生健康委員会は複数回にわたり政策を発表し、実験室の建設強化と核酸検査能力の向上を求めている。広大な市場需要と、技術の急速な反復・アップグレードによる応用範囲の拡大およびコストの低下、そしてそれに伴う政府の支援により、PCR市場規模は急速に成長している。PCR業界は分子診断の黄金のトラックに位置し、市場規模は長期的に高い成長が見込まれている。デジタルPCRはすでに登場しているが、現在の臨床応用においてはまだ探索段階にある。したがって、qPCR技術は将来の分子診断市場において依然として重要な役割を果たす。